首次培養(yǎng)的細胞，是指直接從活體組織取出后的原代細胞，它們最大程度保持了來源組織的生物學(xué)特性以及遺傳信息。在基礎(chǔ)生命科學(xué)研究這兒，原代細胞是模擬體內(nèi)生理狀態(tài)的理想模型，其應(yīng)用涵蓋了藥物篩選、病毒學(xué)研究等好多不同方向。

原代細胞分離技巧

要獲取高質(zhì)量的原代細胞關(guān)鍵環(huán)節(jié)涵蓋組織處理以及酶消化法的挑選，不同組織類型所適用的酶組合具有顯著不同，比如說肝組織通常使用膠原酶，然而神經(jīng)組織卻需要更為溫和的胰蛋白酶，操作期間要把組織剪成 1 至 3 立方毫米的小塊，于 37 度的條件下進行 30 至 60 分鐘的消化工作，在這期間每隔 10 分鐘要輕輕搖晃一回。

細胞懸液經(jīng)消化后，要通過100微米細胞篩進行過濾，以此去除未消化的組織碎片，接著用紅細胞裂解液處理，這樣能夠有效排除血細胞干擾，整個分離過程需控制在2小時內(nèi)完成，因為時間過長會顯著降低細胞活率，新手建議從脾臟或腎臟等結(jié)締組織較少的器官開始練習(xí)。

原代細胞培養(yǎng)難點

原代細胞對于環(huán)境方面的變化是極其敏感的，培養(yǎng)基的構(gòu)成成分、pH的值、滲透壓的微小起伏變動都有可能致使生長呈現(xiàn)停滯狀態(tài)，血清的濃度一般情況下是需要比細胞系高出百分之五至百分之十的程度，并且不同批次的血清是需要預(yù)先進行測試的，培養(yǎng)箱的濕度是必須維持在95%以上的數(shù)值，以此來避免因液體蒸發(fā)而引發(fā)的滲透壓升高。

還有一個常常出現(xiàn)的問題是，成纖維細胞過度地增殖致使目的細胞的生長受到抑制，解決的辦法涵蓋差速貼壁法，通過利用成纖維細胞貼壁更為快速的特性來實施分離，或者朝著培養(yǎng)基里添加適量的L - 亮氨酸甲酯，以此選擇性地清除成纖維細胞，要定期去觀察細胞形態(tài)的變化，一旦出現(xiàn)空泡或者顆粒增多的情況，就應(yīng)當(dāng)馬上調(diào)整培養(yǎng)條件。

原代細胞傳代注意事項

和原代細胞相較，傳代次數(shù)被嚴格限制，一般僅僅能夠穩(wěn)定傳三到五代。每一次傳代之前都得確認細胞融合度處在百分之八十至百分之九十，傳代過晚會加快老化。胰酶消化的時間需要精準(zhǔn)把控，以細胞變圓然而并未脫落作為最佳狀態(tài)，過量消化會對膜蛋白造成損傷。

傳代的比例通常不會超出一比二，然而高密度進行培養(yǎng)反倒有益于維持細胞的功能。建議于傳代之后第一天添加諸如維生素C之類的抗氧化劑，以此幫助細胞去抵抗氧化應(yīng)激。每一次做傳代都需要記錄代數(shù)編號，當(dāng)超過五代之后細胞形態(tài)呈現(xiàn)出梭形化的時候，應(yīng)當(dāng)堅決地丟棄并重新進行制備。

原代細胞凍存與復(fù)蘇

進行原代細胞凍存操作時，要采用那種含有高濃度血清以及10%二甲基亞砜的凍存液，并且要運用程序降溫盒，按照每分鐘下降1度這樣的速率，將其冷卻到零下80度。要是直接把它投入液氮的話，會因為冰晶形成致使細胞膜破裂。每一支凍存管里面的細胞量必須達到1×10的6次方以上，才能夠確保復(fù)蘇之后的存活數(shù)量。

展開復(fù)蘇操作之時務(wù)必要做到快速，把凍存管安置到處于37度溫度的水浴鍋當(dāng)中開展震蕩以此實現(xiàn)解凍，要于1分鐘之內(nèi)達成融化的狀態(tài)，解凍完成之后要馬上運用預(yù)熱的培養(yǎng)基去稀釋二甲基亞砜，以低速的方式進行離心以此去除殘留，復(fù)蘇過后的細胞需要最少經(jīng)24小時才能恢復(fù)到貼壁的狀態(tài)，在這期間不要過于頻繁地去進行觀察或者移動培養(yǎng)瓶，要是活率低于60%，建議重新進行制備而不要勉強去使用。