于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)而言，作為基礎(chǔ)工具的PCR擴(kuò)增試劑盒，其質(zhì)量會(huì)直接對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性以及重復(fù)性產(chǎn)生影響。在市面上，不同品牌、不同型號(hào)的試劑盒，在性能方面存在著明顯差異。怎樣依據(jù)實(shí)驗(yàn)需求去挑選合適的產(chǎn)品，并且正確運(yùn)用從而發(fā)揮出最佳效果，這是每一個(gè)實(shí)驗(yàn)人員必須要掌握的基本功。

擴(kuò)增效率如何保證

DNA聚合酶是試劑盒的核心部分，它的擴(kuò)增效率直接決定著目的片段的產(chǎn)量。對于需要高準(zhǔn)確性的克隆實(shí)驗(yàn)而言，高保真酶是適用的，而普通Taq酶則對于常規(guī)檢測更為適配。在進(jìn)行選擇的時(shí)候，酶的單位活性定義是需要關(guān)注的，不同廠家所標(biāo)注的活性單位有可能存在著差異。與此同時(shí)，緩沖體系當(dāng)中的鎂離子濃度、dNTP配比都會(huì)對擴(kuò)增效率產(chǎn)生影響，優(yōu)質(zhì)的試劑盒會(huì)提供經(jīng)過了優(yōu)化的預(yù)混液，以此來減少用戶自行調(diào)整時(shí)的繁瑣步驟。

特異性怎么提升

在PCR實(shí)驗(yàn)里，非特異性擴(kuò)增屬于最為常見的問題，這主要是由引物跟模板并非完全匹配，又或者是引物二聚體所引發(fā)。采用熱啟動(dòng)技術(shù)的試劑盒能夠?qū)Φ蜏貭顩r下的非特異性結(jié)合起到有效抑制作用，會(huì)顯著提升擴(kuò)增特異性。除此之外，選擇有抗體修飾或者化學(xué)修飾的酶，能夠在室溫條件之下維持酶活性封閉狀態(tài)，只有溫度上升到變性階段的時(shí)候才會(huì)釋放活性。對于像基因組DNA那般的復(fù)雜模板，推薦運(yùn)用添加了特異性增強(qiáng)因子的試劑盒。

常見問題處理辦法

面對擴(kuò)增呈現(xiàn)無條帶狀況時(shí)，首要先去查看模板質(zhì)量以及引物設(shè)計(jì)是不是契合合理標(biāo)準(zhǔn)，接著要去確認(rèn)試劑盒是不是處在有效期里并且儲(chǔ)存是否是妥善得當(dāng)樣式。出現(xiàn)非特異性條帶或者拖尾現(xiàn)象，一般是因?yàn)橥嘶饻囟葍A向于偏低或者循環(huán)數(shù)屬于過多情況，可行使在試劑盒推薦范疇之內(nèi)進(jìn)行適度調(diào)整。部分試劑盒給出優(yōu)化的反應(yīng)程序模板，直接去套用能夠削減參數(shù)摸索所需時(shí)間。針對GC含量比較高的模板，挑選添加了GC增強(qiáng)劑的專用試劑盒能夠明顯改進(jìn)擴(kuò)增效果。

儲(chǔ)存條件注意啥

PCR試劑盒里的酶、引物、dNTP等組分對溫度敏感，得務(wù)必嚴(yán)格依照說明書所要求的儲(chǔ)存條件。常規(guī)試劑盒應(yīng)當(dāng)在-20℃避光保存著，要避免反復(fù)凍融。建議把酶組分分裝成小份，使用的時(shí)候按需取用，以此減少整體性能下降的風(fēng)險(xiǎn)。運(yùn)輸過程當(dāng)中要是使用了干冰或者冰袋，收貨之后得馬上檢查試劑狀態(tài)，確認(rèn)沒有融化痕跡才可以使用。已經(jīng)配制好的反應(yīng)體系應(yīng)該在冰上操作，長時(shí)間放置會(huì)致使酶活性降低。

當(dāng)你在進(jìn)行試劑盒選購這個(gè)行為的時(shí)候，你最為重視看重的究竟是擴(kuò)增效率這一方面、特異性這另一方面，還是操作的便捷性這又一方面呢？歡迎你在評論區(qū)這個(gè)地方分享你自己的使用經(jīng)驗(yàn)。