分子生物學(xué)實驗室里，PCR試劑盒歸屬基礎(chǔ)工具范疇，然而，當(dāng)面對市面上滿是琳瑯品牌及眾多型號的狀況，怎樣去挑選契合自身實驗的試劑盒，又怎樣保證實驗結(jié)果穩(wěn)定可靠起來，這是好多科研人員于實際工作里沒法避開的問題。本文依據(jù)實驗室實際操作經(jīng)驗，從試劑盒選擇型號方面、實驗操作關(guān)鍵要點(diǎn)方面以及常見問題處理這三個方面，整理出一套實用的思路跟方法。

如何根據(jù)實驗類型選試劑盒

做不同實驗，對PCR試劑盒的要求差異極大。普通PCR擴(kuò)增，只需基礎(chǔ)型試劑盒，其包含Taq酶、dNTPs以及反應(yīng)緩沖液便足矣。要是做熒光定量PCR，那就必須選專門的qPCR試劑盒，此類產(chǎn)品中預(yù)混了熒光染料或者探針體系，可實時監(jiān)測擴(kuò)增過程。而對于多重PCR檢測，得選購支持多靶標(biāo)同時擴(kuò)增的試劑盒，這類產(chǎn)品在引物設(shè)計以及酶體系方面做了特殊優(yōu)化。于購買之前，需先弄清楚自身所進(jìn)行的實驗究竟是屬于定性檢測范疇或是定量分析范疇，是僅僅針對單一靶標(biāo)還是涉及多重檢測，而這樣的一種判斷會對試劑盒選型產(chǎn)生直接的影響。

核心組分對結(jié)果的影響有多大

在試劑盒里，酶的性能，直接用以敲定擴(kuò)增效率以及特異性。高保真酶，適用于克隆以及測序等，對于序列準(zhǔn)確性有著高要求的實驗，然而普通Taq酶，更適宜常規(guī)檢測。緩沖液的成分，同樣是很關(guān)鍵的，有些試劑盒，提供出去的是即用型預(yù)混液，僅僅只需加入引物和模板，便能夠上機(jī)，這類產(chǎn)品，操作起來甚是簡便，不過價格卻是偏高的；另外有些是采用分開包裝方式，用戶能夠依據(jù)實驗需求，靈活改變鎂離子濃度等參數(shù)。要加以留意的是，不同品牌的試劑盒，其擴(kuò)增速度存在顯著差異，快速型的試劑盒，能夠把擴(kuò)增時間縮短到30分鐘以內(nèi)，然而，可不是所有的模板都適用它。

實驗重復(fù)性差該怎么排查

實際操作之時，重復(fù)性欠佳乃是最為常見的問題所在。首先得從試劑盒保存這一環(huán)節(jié)著手，酶類組分務(wù)必要嚴(yán)格予以保存在零下二十?dāng)z氏度之處，反復(fù)進(jìn)行凍融的話將會致使酶活出現(xiàn)下降的情況。加樣環(huán)節(jié)所存在的誤差同樣是不能夠被忽視的，建議把預(yù)混液依照所需反應(yīng)數(shù)提前配制成混合體系后，再分裝至各個反應(yīng)管當(dāng)中，如此這般能夠在最大程度上減少加樣所產(chǎn)生的差異。要是使用熒光定量PCR的話，還需要去檢查孔間是不是存在氣泡，氣泡會對熒光信號采集造成干擾。質(zhì)量屬于關(guān)鍵變量范疇的模板，提取后的核酸要進(jìn)行純度以及濃度的檢測，以此保證A260/A280比值處于1.8至2.0這個區(qū)間之內(nèi)。

預(yù)混液能否替代分裝體系

預(yù)混液的現(xiàn)身的確讓實驗操作得以簡化，然而并非適用于所有情形。針對樣本量多的篩選實驗而言，預(yù)混液能夠明顯提高效率且降低污染風(fēng)險，屬于首選辦法。但在對實驗條件予以優(yōu)化時，分裝體系反倒更為靈活，能夠單獨(dú)調(diào)節(jié)引物濃度、鎂離子濃度等參數(shù)。需格外注意的是，部分熒光定量預(yù)混液當(dāng)中已含有參比染料，要是自行額外進(jìn)行添加反而會對儀器校準(zhǔn)造成干擾。選擇何種形式，取決于實驗階段是方法開發(fā)還是常規(guī)檢測。

有沒有在實際的實驗里頭，碰到過PCR的結(jié)果處于不穩(wěn)定狀態(tài)，或者出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增這種狀況呢？最終選用了何種辦法去把它給解決掉的呀？