用于PCR的相關(guān)試劑乃是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的根基所在，其質(zhì)量對(duì)于擴(kuò)增的成敗起著直接決定性作用。從酶開始，一直到引物，再到緩沖液，每一個(gè)構(gòu)成部分都是需要予以嚴(yán)謹(jǐn)評(píng)判考量的。接下來(lái)，將會(huì)從保存、設(shè)計(jì)以及配制這三個(gè)具有關(guān)鍵性質(zhì)的環(huán)節(jié)方面，去分享具備實(shí)用價(jià)值的經(jīng)驗(yàn)。

試劑如何保存

多數(shù)對(duì)溫度波動(dòng)頗為敏感的PCR試劑，特別是聚合酶以及dNTP。在收到試劑之后。要依據(jù)說(shuō)明書來(lái)進(jìn)行分區(qū)存放：酶通常得在-20℃的環(huán)境下避光保存，而預(yù)混液是能夠短暫放置于4℃的。每次取用的時(shí)候必須在冰盒上開展操作，使用完畢后要馬上放回冷凍環(huán)境。反復(fù)凍融是會(huì)極大程度降低酶活性的。建議把大包裝分裝成單次用量的小管，防止整盒反復(fù)升溫。開封之后的試劑要標(biāo)注日期，一旦過期或者顏色出現(xiàn)異常（像是dNTP變黃）就應(yīng)當(dāng)立刻停用。

引物怎么設(shè)計(jì)

PCR特異性的決定因素是引物，設(shè)計(jì)它們的時(shí)候，長(zhǎng)度管控在18至25個(gè)堿基，GC含量為40%至60%，要避免堿基連續(xù)重復(fù)，3’端最后一個(gè)堿基最好選擇G或者C，以此增強(qiáng)結(jié)合效率，還得使用軟件檢查是否存有二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，因?yàn)檫@些副產(chǎn)物會(huì)嚴(yán)重抑制擴(kuò)增，另外，上下游引物的Tm值相差不應(yīng)超過2至4℃，這樣退火溫度才能統(tǒng)一，合成后的引物要用TE緩沖液稀釋到100μM作為母液，長(zhǎng)期保存同樣需要分裝凍存。

體系如何配

反應(yīng)體系的配置需依照“先水后其他”的原則來(lái)進(jìn)行，以此減少氣泡以及污染情況的發(fā)生。要對(duì)各組分的體積做好計(jì)算：模板DNA通常在總體系里所占的比例為1%至10%，引物的終濃度處于0.1至0.5μM的范圍，dNTP的終濃度是0.2至0.4mM，鎂離子（要是使用普通Taq酶的話）的終濃度為1.5至2.5mM。當(dāng)所有試劑都添加完畢后，需輕輕彈擊使其混勻，接著進(jìn)行短暫的離心操作。建議設(shè)置沒有模板的陰性對(duì)照以及已知的陽(yáng)性對(duì)照，借助這兩者來(lái)判斷擴(kuò)增是否具備可靠性。倘若配制好的反應(yīng)板無(wú)法馬上上機(jī)，那么要在避光的條件下放置于4℃，且放置時(shí)間不能超過4小時(shí)。