PCR擴增實驗試劑盒屬分子生物學實驗室的基礎(chǔ)性工具，它把復雜的聚合酶鏈式反應(yīng)所需構(gòu)成部分預先進行了混合，極大地簡化了操作過程。身為實驗人員，對試劑盒的組成以及使用方面的詳情加以理解，會直接對擴增結(jié)果的可靠性和重復性產(chǎn)生影響。接下來從幾個常見問題著手，分享實際工作期間的經(jīng)驗。

試劑盒主要成分有哪些

具有標準特性的PCR擴增實施實驗所使用的試劑盒，一般涵蓋DNA聚合酶，dNTPs，發(fā)揮反應(yīng)調(diào)適作用的緩沖液，還有鎂離子溶液。部分呈現(xiàn)預混樣式的試劑盒，還會增添優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑，像明膠或者 Tween 20 這類物質(zhì)。不同品牌在組分具備的濃度，連帶添加劑范疇有著不同差異情況，這直接對擴增具備的特異性以及靈敏度起到?jīng)Q定性作用。將包裝拆開以后，建議先去核對說明書之中的成分詳盡清單，以此避免出現(xiàn)遺漏狀況。

緩沖液里的pH值以及鹽濃度，對于酶的活性起著極重要的作用，另外鎂離子濃度，更是那影響引物跟模板結(jié)合的關(guān)鍵變量，某些試劑盒會把鎂離子單獨給分裝起來，以便于能夠依據(jù)實驗的需求去進行調(diào)整，除此之外對照試劑像是陽性對照以及陰性對照，在盒子里面也是較為常見的，可用來驗證體系是不是能夠正常地工作。

如何選擇PCR試劑盒

當你在選擇PCR擴增實驗試劑盒之時，首先得明確你所擁有的模板類型，是普通DNA呢，還是cDNA，亦或是富含GC的序列。要是針對于長片段，也就是超過5kb的，或者是高GC含量的模板，那就需要選用專門來設(shè)計的那種聚合酶以及反應(yīng)緩沖體系。普通的Taq酶試劑盒適合進行短片段的擴增，然而高保真試劑盒是被用于克隆測序等那些需要低錯配率的場景之中的。

首先得說，試劑盒的儲存條件以及保質(zhì)期是接下來需要著重予以關(guān)注的要點所在。大多數(shù)不同類型的試劑盒明確規(guī)定，必須放在零下二十攝氏度的環(huán)境當中進行冷凍保存，需要注意的是，多次進行凍存與解凍的操作，必然會使得酶活出現(xiàn)降低的情況。然而，如果一間實驗室不具備能夠進行凍存的條件，那么就可以選擇那種在四攝氏度環(huán)境下具備穩(wěn)定性的改良型試劑盒。除此之外，預混型也就是二倍的主混合物，其在使用方面更為便捷，僅僅只需要添加引物、模板以及水就可以了，這種類型特別適合應(yīng)用于高通量的實驗之中。

PCR擴增實驗注意事項

進行操作時，最難被留意到的便是防污染方面。PCR擴增實驗試劑盒具備極高敏感性，空氣中存在的氣溶膠、操作臺上留存的殘留模板全都有可能致使假陽性產(chǎn)生。提議分區(qū)域來進行試劑配制、樣本添加以及產(chǎn)物檢測，而且要運用帶有濾芯的移液槍頭。每次開展實驗都得設(shè)置無模板對照，以此來監(jiān)控污染狀況。

另一個關(guān)鍵之處在于，退火溫度的設(shè)定。即便試劑盒給出了推薦溫度，然而實際的最佳退火溫度，依舊會因為引物序列的不同而有所差異?？梢岳锰荻萈CR儀，在55至65℃這個范圍進行測試，從而找到擴增條帶最為明亮，并且不存在非特異性條帶的那個溫度。另外，延伸時間需要依據(jù)目標片段的長度來進行調(diào)整，通常而言，每kb設(shè)置30至60秒，要是過長的話，容易出現(xiàn)彌散條帶。

提高擴增效率技巧

是在擴增產(chǎn)量呈現(xiàn)偏低狀況或者條帶微弱的時候能嘗試一下調(diào)整反應(yīng)循環(huán)數(shù)，一般而言30到35個反應(yīng)循環(huán)就把足夠檢測給涵蓋了，然而低拷貝模板是能夠把循環(huán)數(shù)增至40個的，并且還要檢查模板質(zhì)量，純度差的DNA是會抑制聚合酶活性的，建議運用核酸純化柱重新提取，另外添加5%的DMSO或者甜菜堿能夠有助于打開二級結(jié)構(gòu)，這是適合高GC模板的。

如果出現(xiàn)了引物二聚體，那么這表明引物設(shè)計或許存在問題，又可能是退火溫度相對偏低。在這時，應(yīng)當重新去設(shè)計引物，要讓其二聚體的Tm值相近，而且還要避免3’端出現(xiàn)互補的情況。也能夠運用試劑盒里的鎂離子濃度，從1.5 mM開始一步步地提升至2.5 mM，去觀察二聚體是否會有所減少。要記錄下每次優(yōu)化的參數(shù)，逐漸構(gòu)建起適配自己體系的標準化流程。