在分子生物學實驗室里，常用的工具是PCR擴增實驗試劑盒，它把復雜的PCR反應所需要的組分預先進行了混合優(yōu)化，使得實驗者只要加入模板和引物就能夠上機進行擴增。要是正確地選擇并且使用試劑盒，那么就能顯著地提升擴增的特異性以及產(chǎn)率，還能避免出現(xiàn)非特異性條帶以及拖尾現(xiàn)象。而理解試劑盒各個組分的作用以及操作要點，這是獲得可靠數(shù)據(jù)的前提條件。

PCR試劑盒怎么選

進行挑選之際，首要需考慮的是擴增片段的長度以及GC含量。普通的Taq酶試劑盒適宜用于擴增3kb以內(nèi)的片段，而高保真酶試劑盒乃為用于那些需要精準擴增的克隆實驗。要是模板屬于復雜基因組或者擁有高二級結構，那么應當選擇添加了增強劑的專用試劑盒。與此同時，要注意熱啟動酶能夠有效地防止低溫狀況下的非特異性擴增，此乃是提高特異性的關鍵所在。除此之外，依據(jù)下游應用來選擇是否帶有染料，直接上樣電泳的試劑盒能夠節(jié)省時間。

擴增效率如何提升

受退火溫度影響，受引物設計影響，受循環(huán)參數(shù)影響，擴增效率會發(fā)生變化。使用試劑盒推薦的標準程序，通常能夠獲得良好結果，但是不同的引物，存在需要優(yōu)化退火溫度的情況。建議先進行梯度PCR測試，通過該測試找到最佳溫度。除此以外，延伸時間應當充足，一般每1kb片段設置30到60秒。循環(huán)數(shù)控制在30至35個，過多會致使平臺期和非特異性條帶出現(xiàn)。模板質(zhì)量也是至關重要的，降解或含抑制物這樣的模板需要進行純化處理。

操作有哪些注意點

加樣動作進行的時候，一定要在處于低溫狀態(tài)的冰上開展操作，以此達到防止酶的活性出現(xiàn)下降這么一種情況的目的。各個組成部分需要做到充分的混合均勻，并且進行短時間的離心操作，以此避免氣泡對熱傳導產(chǎn)生影響。把試劑盒當中的dNTP以及酶進行分裝，能夠減少反復凍融的情況發(fā)生，在使用之前要進行徹底的溶解并且進行渦旋處理。設置陰性對照（也就是沒有模板的情況）以及陽性對照（也就是已知模板的情況），用來監(jiān)控是否存在污染。每一次都要更換移液器上的吸頭，這樣子才能夠避免出現(xiàn)交叉污染這種狀況。推薦選用帶有濾芯的吸頭，這樣可以防止因為氣溶膠污染從而引發(fā)出假陽性的情況出現(xiàn)。

試劑盒怎么保存

大多數(shù)PCR試劑盒當中的酶以及dNTP應當長時間保存于零下二十攝氏度，緩沖液能夠短期放置在四攝氏度。反復進行凍融將會致使酶活性逐次降低百分之十到百分之二十，建議首次開展使用之后分裝成小份。要留意避光進行保存，某些熒光染料組分遇到光容易發(fā)生降解。在使用之前需要把各組分完全解凍并且顛倒混勻，千萬不要劇烈震蕩從而產(chǎn)生泡沫，以免對加樣精度造成影響。運輸?shù)臅r候保持干冰環(huán)境，收到之后立刻按照說明存放。