原代細(xì)胞中的兔原代細(xì)胞，在生物研究里作為重要模型，由于其遺傳背景均一，還操作性強(qiáng)，常常被運(yùn)用在各類機(jī)理探索方面。怎樣去獲得活力高且純度好的原代細(xì)胞，這是實(shí)驗(yàn)成功的第一步。

分離操作有哪些要點(diǎn)

組織取材要在動(dòng)物被處死后的30分鐘之內(nèi)完成，以此來防止酶解之前細(xì)胞活力出現(xiàn)相應(yīng)下降情況。剪碎組織之際要維持冰浴狀態(tài)，采用膠原酶跟胰酶聯(lián)合起來進(jìn)行消化，時(shí)間把控在40分鐘到60分鐘這個(gè)范圍，在這期間要輕柔地?fù)u晃以便助力消化。終止消化之后要快速地過篩，進(jìn)行三次離心洗滌，從而去除雜質(zhì)以及碎片。

培養(yǎng)條件如何優(yōu)化

選擇作為最初培養(yǎng)用的基，要用添加了百分之十胎牛血清的那種DMEM/F12，還要補(bǔ)充雙抗以及谷氨酰胺。一開始接種時(shí)的密度，建議按照每平方厘米2×10?個(gè)的標(biāo)準(zhǔn)來，然后放置在含有百分之五二氧化碳、溫度為37度的恒溫培養(yǎng)箱里。第一次進(jìn)行換液是在24小時(shí)之后，目的是把沒有貼壁的細(xì)胞給去除掉，之后每隔兩天換液一回。

常見污染與解決方法

存在細(xì)菌污染時(shí)，多呈現(xiàn)出培養(yǎng)基迅速變黃的狀況，且伴有渾濁現(xiàn)象，這種情況下需即刻將其丟棄，同時(shí)要對(duì)培養(yǎng)箱展開全面消毒。當(dāng)出現(xiàn)真菌污染時(shí)，會(huì)呈現(xiàn)出絮狀漂浮物，它相對(duì)較難被根除，對(duì)此建議重新獲取材料。若支原體污染隱蔽，可定期運(yùn)用熒光染色或者PCR檢測(cè)，并且要在培養(yǎng)基里添加抗支原體試劑來進(jìn)行預(yù)防。

傳代與凍存注意事項(xiàng)

在細(xì)胞融合度達(dá)到80%這個(gè)時(shí)候，采用0.25%的胰酶 - EDTA來進(jìn)行消化，于顯微鏡下面觀察，當(dāng)細(xì)胞變成圓形的時(shí)候就終止消化。傳代的比例按照1比2或是1比3來開展。凍存液運(yùn)用血清再加上10%的二甲基亞砜，經(jīng)過程序降溫之后轉(zhuǎn)進(jìn)液氮里面，復(fù)蘇的時(shí)候進(jìn)行快速融化，通過離心去除凍存液以此來減少對(duì)細(xì)胞的損傷。