在原代細胞培養(yǎng)過程中，微生物污染的判斷與處理需結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、培養(yǎng)液變化及專業(yè)檢測手段，具體方法及處理流程如下：

一、微生物污染的判斷方法

1.細菌污染

肉眼觀察：培養(yǎng)液短期內(nèi)（24-48小時）變渾濁、發(fā)黃，pH值降低（酚紅指示劑變黃）。

鏡下特征：

高倍鏡下可見大量游動的球狀或桿狀顆粒。

細胞間隙出現(xiàn)黑色沙粒狀物質(zhì)，細胞形態(tài)異常（顆粒增多、變圓脫落）。

2.真菌污染

肉眼觀察：培養(yǎng)液清亮但漂浮白色/淺黃色絮狀物。

鏡下特征：

絲狀、管狀或樹枝狀菌絲縱橫于細胞間。

酵母菌呈卵圓形，散在細胞周邊。

3.支原體污染（隱蔽性強）

間接跡象：細胞生長緩慢、變圓脫落，但培養(yǎng)液無渾濁。

確診方法：

熒光染色：Hoechst 33258染色后，熒光顯微鏡下可見附于細胞表面的綠色熒光點。

PCR檢測：特異性引物擴增支原體DNA（如MB公司試劑盒）。

4.其他污染

病毒：需電鏡或RT-PCR檢測，常見于動物源組織。

黑膠蟲：高倍鏡下見黑色游動小點，不影響短期生長。

二、污染后的處理流程

1.評估污染程度

輕度污染（僅個別培養(yǎng)皿）：嘗試挽救。

重度污染（大面積渾濁/菌絲）：立即廢棄，徹底消毒環(huán)境。

2.針對性處理措施

細菌/真菌污染：

加入5-10倍常規(guī)濃度的抗生素（如慶大霉素50μg/mL + 兩性霉素B 2.5μg/mL），48小時后換液。

若無效，棄用細胞并高壓滅菌污染樣本。

支原體污染：

使用專用清除劑（如Zell Shield或BM-Cyclin），按1:100加入培養(yǎng)基，連續(xù)處理3-4代。

配合"懸浮沖洗法"：PBS反復(fù)懸浮細胞，低速離心棄上清，去除表面支原體。

頑固污染：

裸鼠體內(nèi)接種法（珍貴細胞），利用宿主免疫清除微生物。

3.環(huán)境與器材消毒

實驗臺、培養(yǎng)箱用支原體祛除噴霧（如Mycoplasma Off?）擦拭，通風(fēng)后使用。

耗材高壓滅菌，試劑更換新批次（避免血清攜帶污染）。

       三、預(yù)防措施

嚴格無菌操作：

穿戴實驗服/手套，操作前紫外線消毒超凈臺30分鐘。

試劑質(zhì)量控制：

選擇無支原體血清（如Ausbian血清，經(jīng)0.1μm過濾）。

原代細胞專用抗生素短期添加（翌圣生物廣譜制劑，100-300μg/mL）。 0.1μm過濾設(shè)備 原代細胞

定期監(jiān)測：

每月PCR檢測支原體，每批細胞凍存前熒光染色篩查。

關(guān)鍵提示：原代細胞對污染更敏感，且挽救成功率低，預(yù)防優(yōu)于處理。一旦污染嚴重影響細胞狀態(tài)（如生長停滯、異常脫落），建議棄用并重新取材。